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John McLoughlin est né à Rivière-du-Loup en 1784. Son père John McLoughlin est d’origine irlandaise et sa mère Angélique Fraser est d’origine écossaise par son père Malcolm Fraser de Mont-Murray et canadienne-française par sa mère Marie Allaire de Beaumont.

En 1790, ses parents habitent à Québec chez Marie Allaire qui possède une maison sur la rue Sainte-Geneviève. Le biographe de Malcolm Fraser retrace les naissances des derniers enfants du couple au registre de Notre-Dame de Québec en 1790 et 1792. Le grand-père a selon lui obligé sa fille Angélique et son gendre John McLoughlin, irlandais et catholique, à éduquer leurs enfants à Québec dans la religion protestante.

John McLoughlin reçoit donc une éducation protestante et étudie dès l’âge de six ans à Québec. À l’âge de quatorze ans, il devient l’élève du médecin James Fisher et à dix-neuf ans, il obtient l’autorisation de pratiquer au Bas-Canada. Il signe un contrat pour la North West Company et travaille pendant cinq ans comme médecin et apprenti commis. C’est là qu’il développe un intérêt soudain pour le commerce des fourrures.